ארתור רופין נולד בעיר ראביץ' (ליד פוזנן), אז בפרוסיה שבקיסרות הגרמנית, בן בכור ליצחק אלברט ולסיציליה (בת יוליוס בורק) רופין, משפחה מסורתית אמידה. ביומנו תיאר את שנות ילדותו המוקדמות כמאושרות מאוד. אולם אביו של רופין פשט את הרגל, עסקו נסגר והמשפחה התקיימה בעוני מתרומות של בני משפחה. בעקבות זאת, עברה המשפחה בשנת 1886 למגדבורג. רופין היה תלמיד מצטיין וספג בחדווה את התרבות הגרמנית הפרוטסטנטית, במקביל להתרחקותו מהמסורת היהודית שאותה ייצגו הוריו אותם האשים בעוניה של המשפחה. בגיל 12 קרא את כל כתבי גתה ולאחר בר המצווה שלו העתיק הצגה שלמה של פרידריך שילר במטרה לזכור אותו בעל פה. כרבים מבני אותה תקופה חלם להיות למשורר גרמני.

בגיל 15 נאלץ להפסיק את לימודיו מסיבות כלכליות, ועבד בבית מסחר גדול לתבואות של שכן יהודי. הוא החל את עבודתו כשוליה, אך מהר מאוד קודם לתפקידי ניהול, וכבר לפני מלאת לו 17 היה ליועץ למנהל העסק וניהל עסקאות גדולות שנוהלו לרוב רק בידי פקידים בכירים‏.. במקביל לעבודתו למד לקראת מבחני סיום הגמנסיה כנבחן אקסטרני והכשיר את עצמו להיות גרמני ראוי בלימודי שחייה, התעמלות, ריקוד וירי‏.

לאחר שהשלים את לימדיו בעצמו ועמד בהצלחה בבחינות כנבחן אקסטרני, התקבל לאוניברסיטת ברלין בשנת 1896, אולם עקב עבודתו במגדבורג החל ללמוד רק באפריל 1899. במשך סמסטר אחד שמע הרצאות בפקולטה למשפטים באוניברסיטת ברלין אולם למד גם מגוון רחב של קורסים במקצועות שונים. לאחר שעבר להתגורר בהאלה המשיך את לימודיו בהתכתבות, בלי שהשתתף בשיעורים בפועל‏[4]. רופין למד גם באוניברסיטת האלה משפטים וכלכלה. ב-1902 קיבל תואר דוקטור בכלכלה פוליטית על תאורית הערך של תונין פרס קרופ.

חבר של רופין ומנחהו באוניברסיטה שכנעו אותו להשתתף בתחרות כתיבת עבודות באאוגניקה שנודע אחר כך כפרס קרופ, ומאמר שלו בשם "דרוויניזם ומדעי החברה" זכה במקום שני בפרס קרופ‏.בסך של 6,000 מרק, שהיו שווי ערך למשכורת שנתית של פקיד בכיר. רופין השתמש בכסף כדי להתרכז במחקריו וכן סייע בכסף לאחיו ולאחותו לפתוח עסקים משלהם.

זכייתו של רופין בפרס קרופ פתחה בפניו את השערים לחברה הגרמנית והוא פרסם מספר מאמרים בכתבי עת גרמניים בנושאי אאוגניקה. במקביל, בשנים 1902-1907, עבד כעורך דין והרגיש את מלוא עוצמתה של האנטישמיות הגרמנית שגרמה לו לעסוק בנושא היהודי. כבר בשנת 1902 הוא כתב מאמר דמוגרפי שהתפרסם בכתב עת מדעי כללי על היחסים של יהודי פרוסיה עם גרמניה. בשנת 1903 ביקר בגליציה ואסף מידע אנתרופולוגי על היהודים בה. בשנת 1904 עבר לברלין ועבד במכון לסטטיסטיקה של היהודים מיסודו של אלפרד נוסיג, ובמהרה מונה למנהל המכון.

ב-1905 הצטרף רופין להסתדרות הציונית, לאחר שהשתתף באותה שנה בקונגרס הציוני העולמי בבזל. הוא שולב בתת-ועדה כלכלית, ובשנת 1906 הצטרף למחלקה המשפטית של הוועד הפועל הציוני. ב-1907, בהמלצת אוטו ורבורג ויעקב טהון, נשלח על ידי דוד וולפסון, נשיא ההסתדרות הציונית, לחקור את מצב היישוב בארץ ישראל ולבדוק את האפשרויות לפיתוח החקלאות והתעשייה. בדצמבר 1907 הגיש דו"ח מפורט שהמליץ על רכישה נרחבת של אדמות בארץ ישראל והשגת רוב יהודי בגליל ובמישור החוף‏..

בשנת 1908 עלה ארתור רופין לארץ וייסד ביפו את "המשרד הארצישראלי" שמטרתו הייתה לכוון ולנהל את כל פעולות ההתיישבות בארץ ישראל מטעם התנועה הציונית העולמית, בהתאם להחלטת הקונגרס הציוני השמיני. בתחילה, שולמו משכורותיהם של רופין ושל עוזרו יעקב טהון על ידי פטרונו אוטו ורבורג בגלל סירובו של הוועד הפועל הציוני לממן את גישת הציונות המעשית של רופין עם זאת, החוזה של רופין העניק לו סמכויות נרחבות ביישום הוראות ההסתדרות הציונית. הגיבוי המלא שקיבל ממעסיקיו אפשר לרופין חופש פעולה מלא ועצמאות בקביעת המדיניות בארץ ישראל. רופין ביקש לרכז את עיקר הכוחות הפועלים ביישוב היהודי בארץ ישראל תחת המשרד הארצישראלי ולכוון את פעולות ההתיישבות מלמעלה‏.. תוך זמן קצר מהגעתו לארץ ישראל, החל המשרד הארצישראלי לייצג במידה זו או אחרת גופים ציוניים רבים, בהם הקרן הקיימת לישראל, הכשרת היישוב, בצלאל, נטעים וגאולה. רופין דאג לתאם את פעולות רכש הקרקעות בין הגופים השונים, על מנת למנוע עליית מחירים בגלל תחרות על רכישת הקרקעות‏.

רופין ראה מהתחלה את מטרתו בהקמת בסיס יהודי עצמאי בארץ ישראל שאינו תלוי בשלטונות או בערביי ארץ ישראל. כדי להעביר את מרכז הכובד הכלכלי של היישוב היהודי לידי יהודים, הוא תמך בהקמת תל אביב ודחף לפיתוח העיר, למשל על ידי הקמת הגימנסיה העברית "הרצליה" בתל אביב, הרחק ממקום מגוריהם של רוב התלמידים, וזאת תוך מאבק בהתנגדות ההורים. רופין הטיף לפעילות מהירה ודחופה ליישוב הארץ והיו שהאשימו אותו בכך שהדבר בא על חשבון איכות הבנייה. במקרים רבים חתם רופין על עסקאות בכספי קק"ל וארגונים אחרים אף בטרם קיבל אישור מסודר מהגורמים המוסמכים, וזאת בגלל תחושת הדחיפות ותפיסתו את הסביבה העסקית בארץ ישראל‏.. רופין גם השתדל לעבוד בפרופיל נמוך ואף ביקש מהקונגרס הציוני להימנע מדיונים פומביים בנושאי הפעילות בארץ ישראל, על מנת למנוע מהמידע להגיע לידי הערבים או לידי גורמים ספקולטיביים שהיו עלולים להפריע במימוש עסקאות לרכישת אדמות. מרגלית שילה אף טענה שחלק מהצהרותיו של רופין בקונגרס הציוני היו בניגוד למעשיו בפועל‏.

רופין דחף לתוכנית שתחבר צעירים יהודיים ממזרח אירופה להתיישב בארץ ישראל. הוא יזם תכוניות לרכישת קרקעות שיועברו לשימוש עולים חסרי אמצעים שיתיישבו עליהם כחוכרים או שיירכשו אותם בפריסת תשלומים על פני תקופה ארוכה‏[16]. כמו כן, יזם רופין מסעות שיווק של קרקעות בארץ ישראל במגוון תכניות כדי למשוך בעלי אמצעים לקנות קרקעות בארץ ישראל. על מנת למנוע את איבוד הקרקעות שנרכשו, בהתאם לחוק העות'מאני הקובע שמי שמעבד קרקע שאינה מעובדת במשך שלוש שנים יכול לזכות בבעלות עליה, וכדי להכשיר את הקרקע שתצלח להתיישבות קבע, ארגן רופין קבוצות עבודה שהתיישבו על הקרקע.

בשנת 1908 יזם המשרד הארצישראלי בראשותו של ארתור רופין את הקמתן של חוות חקלאיות להכשרת פועלים להתיישבות חקלאית, והעמיד לרשותן מומחים לחקלאות ואגרונומים. כך הוקמו חוות בחיטין, בדלייקה, באום ג'וני, בבית עריף (בן שמן), בחולדה, בחוות פוריה, בשרונה, בכפר אוריה, חוות חפציבה בחדרה, ואף ראשיתה של העיר עפולה הייתה בחווה חקלאית.

 ב-1920 הזמין רופין את הארכיטקט היהודי-גרמני, ריכרד קאופמן, לעלות ארצה ולהכין תוכנית אב כוללת ליישובים החקלאיים בארץ ישראל ולשכונות בעריה. רופין יזם את ההתיישבות הקבוצתית בדגניה ובכנרת, את עליית יהודי תימן, את מתן ההלוואה הראשונה ל"אחוזת בית" היא תל אביב, את ייסוד הקואופרציה והמושבה במרחביה, את הקמת "חברת הכשרת היישוב", היה ממייסדי שכונת רחביה בירושלים (שבה בנה את ביתו) ועוד. הוא היה חבר "ועד הצירים" וההנהלה הציונית, ניהל את מחלקת ההתיישבות, היה חבר הנהלת הסוכנות היהודית ועמד בראשה בשנים 1933-‏1935. רופין הזמין אצל מהנדס המים שמחה בלאס את תוכנית "פנטסיה להשקיית הנגב", שהוגשה לו ביולי 1939.

 במהלך השנים עד כיבוש ארץ ישראל בידי הבריטים במלחמת העולם הראשונה היו לרופין קשרים טובים עם שגריר גרמניה בארץ ישראל, והוא נעזר בו בקידום פעילות ההתיישבות הציונית. במיוחד סייעה התמיכה הגרמנית במאבק כנגד התנכלויות מצד השלטון העות'מאני.

משנת 1926 ועד לפטירתו שימש רופין כפרופסור לסוציולוגיה יהודית באוניברסיטה העברית בירושלים. הוא היה ממייסדי "ברית שלום" ומהמטיפים למדינה דו-לאומית, אולם פרש מהברית לאחר טבח חברון ומהומות-הדמים באב תרפ"ט (אוגוסט 1929), ומאז סירב אף לדון בוויתור כלשהו על עליית יהודים לארץ ישראל ועל רכישת קרקעות. הוא אף סבר כי "התעמולה של "ברית שלום" עלולה להזיק יותר משהיא עשויה להועיל.",‏[18] וכי רק נוכחות יהודית חזקה תשכנע את הערבים "שלא יהיה להם שום סיכוי להיפטר מאתנו".".‏[18] רופין נפטר בירושלים בשנת 1943, ונטמן בבית הקברות של דגניה א'.